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引加生物的T5核酸外切酶沿5′→3′方向降解DNA。T5核酸外切酶既能從線性或切刻雙鏈DNA（dsDNA）的5′ 末端起始消化，也能從線性或環狀dsDNA的缺口或切刻處起始消化。然而該酶不會降解超螺旋dsDNA。T5核酸外切酶還具有單鏈DNA（ssDNA）核酸內切酶活性。

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